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Por que esta técnica?
A cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) é frequentemente o método de escolha para a separação de moléculas pequenas. A extracção e a purificação das biomoléculas, contudo, são desafiantes para as seguintes razões:
Mantendo estes conceitos na mente, Pharmacia desenvolveu a técnica da cromatografia líquida da proteína rápida em 1982 para fornecer um método para a separação de biomoléculas.
Algumas características básicas de FPLC
O objetivo de FPLC é purificação de uma biomolécula (biopolymer, proteína, peptide), o tamanho de que pode ser diverso mil Daltons. O quantity de amostra pode variar de aproximadamente 100 ml a diversos litros. Como é comum com biomoléculas, o eluente é um amortecedor, por sua vez compo frequentemente de dois ou mais amortecedores. É igualmente importante os componentes do eluente usados é biocompatible e não reage com a substância que está sendo refinada (os exemplos seriam Teflon, titânio, vidro).
O instrumento inteiro da cromatografia de FLP é usado frequentemente em uma sala fria (ou em 4°C) de modo que a estrutura da proteína que está sendo refinada não seja perturbada. Enquanto as pressões usadas estão frequentemente na escala de algumas barras, o método está referido às vezes como a cromatografia líquida da media-pressão; e como isto é usado refinando biomoléculas, a técnica igualmente referiu como o biopurification ou o biochromatography.
A fase estacionária em FPLC é frequentemente uma resina. A troca iónica, filtragem de gel, inverteu – a fase, e a cromatografia de afinidade são os modos comuns usados no processo de FPLC, e há igualmente uma escolha larga das resinas disponíveis para cada um destes modos. Às vezes, uma combinação destes modos é usada. A primeira etapa no isolamento de uma proteína de um extracto bruto é frequentemente cromatografia de afinidade. Isto pode então ser sujeito à cromatografia da troca iónica remover os contaminadores. Quando não é possível obter uma proteína pura no pas-de-deux uma terceira etapa tal como a cromatografia da íon-mudança pode igualmente ser usada para obter o produto puro remaining.
O amortecedor usado como a fase móvel e o tipo de resina usado formam um par. Adicionalmente e como já mencionado, o amortecedor próprio pode ser um amortecedor da combinação, compo de um amortecedor working e de um amortecedor da eluição. Quando o amortecedor working corre através de uma coluna cromatográfica, a amostra está aplicada por uma bomba da amostra. Porque a amostra corre através da coluna, a proteína do interesse é fixada selectivamente pela resina; os outros componentes na amostra fluem simplesmente fora do sistema. O inclinação do amortecedor é mudado então introduzindo o amortecedor da eluição com a ajuda das válvulas demistura. Como cada vez mais do amortecedor da eluição flui na coluna cromatográfica, a proteína do interesse separa-se da resina e flui-se para fora com o amortecedor do eluente. A presença da proteína no eluente é confirmada por um detector que meça a concentração da proteína.
Aplicações de FPLC – “fast protein liquid chromatography pdf”
Líquidos de corpo tais como o plasma, urina, e os líquidos cerebrospinais contêm uma variedade de proteínas e peptides, e FPLC provou ser um rápido e seguro técnica para um estudo dos marcadores nestes líquidos. O perfil da lipoproteína, por exemplo, pode ser obtido com FPLC. O perfilamento das proteínas em líquidos cerebrospinais foi útil em detectar mudanças na constituição do líquido em estados da doença.
Enquanto os polinucleotido podem igualmente ser estudados por FPLC, a técnica estêve usada para a purificação rápida do RNA e do ADN do plasmídeo.
O perfilamento da proteína de FPLC foi usado igualmente na purificação dos venenos animais assim como no diagnóstico do beta-thalassemia. Seu uso em identificar o microvariability dentro de uma única proteína é considerado igualmente para ter a importância clínica.
FPLC foi usado razoavelmente extensivamente em analisar os componentes nitrogenous da cerveja, que são acreditados para jogar um papel na estabilidade de espuma.
A purificação do deaminase do porphobilinogen dos eritrócites humanos, assim como a purificação dos anticorpos e das vacinas para várias finalidades, foram facilitadas pelo uso de FPLC.
Fontes
Additional Studying
“fast protein liquid chromatography pdf”